Ένα πανίσχυρο εργαλείο τροποποίησης του DNA
Λίγα χρόνια μετά την ανακάλυψη του συστήματος CRISPR-Cas ως εργαλείο τροποποίησης του γενετικού υλικού των οργανισμών, είναι δύσκολο να φανταστεί κανείς μια τεχνολογία με μεγαλύτερη επίδραση στην βιολογία και την ιατρική από αυτήν. Θεωρήθηκε η σπουδαιότερη επιστημονική ανακάλυψη των τελευταίων χρόνων και όχι άδικα: η γονιδιωματική επεξεργασία με το εν λόγω σύστημα έχει θεωρητικά απεριόριστες εφαρμογές με κυριότερη την αντιμετώπιση γενετικών ασθενειών. Ταυτόχρονα, όμως, εγείρει και κρίσιμα βιοηθικά ζητήματα.
Τροποποίηση του γονιδιώματος: ένας δρόμος μακρύς και δύσκολος
Η γονιδιωματική τροποποίηση αποτελεί τμήμα της γενετικής μηχανικής που σχετίζεται με την εισαγωγή, την απαλοιφή ή την αντικατάσταση τμήματος DNA από το γονιδίωμα ενός οργανισμού. Για να επιτευχθεί αυτό χρησιμοποιούνται ειδικές πρωτεΐνες, οι νουκλεάσες, που δρουν σαν ψαλίδια τα οποία κόβουν το DNA σε επιλεγμένα σημεία. Την επιδιόρθωση της βλάβης αναλαμβάνουν μηχανισμοί του κυττάρου και το αποτέλεσμα είναι να δημιουργούνται μεταλλάξεις στα σημεία αυτά.
Ήδη από την δεκαετία του 1970 ήταν γνωστές οι βασικές αρχές της γενετικής μηχανικής. Οι επιστήμονες μπορούσαν να κόψουν το DNA και να δημιουργήσουν ανασυνδυασμένο που περιείχε κομμάτια γενετικού υλικού από διαφορετικούς οργανισμούς, με επιθυμητές ιδιότητες. Οι φιλοδοξίες των επιστημόνων για την τροποποίηση του γενετικού υλικού και τις ενδεχόμενες εφαρμογές της στην έρευνα και στην ιατρική ήταν πολλές αλλά ο δρόμος αποδείχθηκε μακρύς και δύσκολος. Η επιστημονική κοινότητα για χρόνια επιχείρησε να εφεύρει μεθόδους παρέμβασης στο γονιδίωμα προκειμένου να κατανοήσει πως λειτουργούν τα γονίδια και τι επίδραση μπορεί να έχουν οι μεταλλάξεις σε αυτά. Η ύπαρξη ενζύμων που κόβουν συγκεκριμένα μοτίβα αλληλουχιών στο DNA ήταν ήδη γνωστή αλλά τα ένζυμα αυτά μπορούν να κόψουν το DNA σε διάφορες περιοχές και επομένως η εξειδίκευσή τους ως προς την αλληλουχία την οποία αναγνωρίζουν αποδείχθηκε περιορισμένη.
Το 1985 ανακαλύφθηκαν οι νουκλεάσες δακτύλων ψευδαργύρου ZFN (Zing - Finger Nucleases), πρωτεΐνες, δηλαδή, οι οποίες ονομάστηκαν έτσι λόγω της χαρακτηριστικής τρισδιάστατης δομής τους. Οι ZFN βρέθηκε ότι μπορούν να αναγνωρίσουν και να δεσμευτούν σε συγκεκριμένα σημεία στο DNA, γεγονός που αντιμετωπίστηκε με ενθουσιασμό από την επιστημονική κοινότητα. Με διάφορες τροποποιήσεις αυτές οι νουκλεάσες μπορούν να σπάσουν την διπλή έλικα του DNA σε επιλεγμένα σημεία. Τα σπασίματα επιδιορθώνονται με την βοήθεια μηχανισμών που διαθέτουν τα κύτταρα και έτσι προκύπτουν μεταλλάξεις στα επιθυμητά σημεία- στόχους.
Αργότερα ανακαλύφθηκαν οι νουκλεάσες τύπου TALEN (Τranscription Αctivator - Like Effector Nucleases). Πρόκειται για ένζυμα με ακόμα μεγαλύτερη ειδικότητα ως προς τις αλληλουχίες DNA- στόχους που δρουν με παρόμοιο τρόπο σε σχέση με τις ZFN. Επομένως ένα ακόμα «μοριακό ψαλίδι» προστέθηκε στην εργαλειοθήκη των ερευνητών. Και οι δύο τεχνολογίες έχουν εφαρμοστεί για την δημιουργία πληθώρας γενετικά τροποποιημένων φυτών και ζώων.1
CRISPR-Cas: μια νέα εποχή στη γενετική μηχανική
Όπως αποκαλύπτει και η ονομασία του, το σύστημα αυτό αποτελείται από δύο συστατικά: το CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) που αφορά επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες DNA που βρίσκονται διάσπαρτες στο γενετικό υλικό και τις πρωτεΐνες Cas που αποτελούν μια κατηγορία ενζύμων (νουκλεάσες) που κόβουν τα νουκλεϊκά οξέα (DNA ή RNA). Σε αντίθεση με τις προηγούμενες μεθοδολογίες τροποποίησης του γενετικού υλικού, η τεχνολογία CRISPR-Cas παρουσιάζει μεγαλύτερη εξειδίκευση ως προς το DNA- στόχο και θεωρείται πολύ απλή και αξιόπιστη.2 Πως όμως ξεκίνησαν όλα;
Οι αλληλουχίες CRISPR εντοπίστηκαν και περιγράφτηκαν πρώτη φορά το 1987. Το σύστημα CRISPR-Cas ανακαλύφθηκε αρχικά στα βακτήρια το 2007 και κατόπιν στα αρχαία. Πρόκειται για ένα μηχανισμό άμυνας των βακτηρίων προκειμένου να προστατεύονται από ιικές επιθέσεις. Όταν ένας ιός επιτίθεται σε ένα βακτήριο, το σύστημα CRISPR του βακτηρίου αιχμαλωτίζει τμήμα του γενετικού υλικού του ιού και το ενσωματώνει στο δικό του DNA. Αρχικά το ιικό DNA κόβεται σε κομμάτια και ενσωματώνεται στην αλληλουχία CRISPR του βακτηρίου. Στη συνέχεια οι αλληλουχίες μεταγράφονται, δηλαδή το DNA μετατρέπεται σε RNA, το οποίο κόβεται επίσης σε μικρά κομμάτια, τα CRISPR RNAs. Αυτά ακριβώς τα κομμάτια προσδένονται στις πρωτεΐνες Cas, οι οποίες δρουν σαν μοριακά ψαλίδια. Τα σύμπλοκα αυτά δρουν σαν ανιχνευτές και όταν ο ίδιος ιός εισβάλλει ξανά στο βακτήριο, τον εξολοθρεύουν άμεσα, κόβοντας το γενετικό του υλικό. Έτσι ο ιός- εισβολέας δεν μπορεί να πολλαπλασιαστεί μέσα στο βακτηριακό κύτταρο το οποίο αποκτά με αυτόν τον τρόπο επίκτητη ανοσία από μελλοντικές μολύνσεις από αυτόν.
Όπως σχεδόν όλες οι μεγάλες ανακαλύψεις, έτσι και αυτή, αποτέλεσε προϊόν μακροχρόνιας και επίπονης έρευνας πολλών ερευνητικών ομάδων παγκοσμίως.3 Πολλοί αφανείς ήρωες, ερευνητές και ερευνήτριες από όλο τον κόσμο, αφοσιώθηκαν με πάθος στην έρευνα γύρω από το σύστημα CRISPR και συνέβαλαν σε σπουδαίες ανακαλύψεις, χωρίς τα ονόματά τους να γίνουν γνωστά στο ευρύ κοινό. Ο Ισπανός μικροβιολόγος Francisco Mojica ήταν ο πρώτος που αντιλήφθηκε ότι το σύστημα CRISPR αποτελεί έναν αμυντικό μηχανισμό των βακτηρίων απέναντι στους ιούς. Εργάστηκε πάνω στο συγκεκριμένο ερευνητικό αντικείμενο από το 1993 έως το 2005 και στα συμπεράσματά του βασίστηκαν οι επόμενες μελέτες. Ακολούθησαν πολλές δημοσιεύσεις που συνέβαλαν στην ακριβή περιγραφή του συστήματος CRISPR-Cas και στην πληρέστερη κατανόηση της λειτουργίας του. Αξίζει να αναφερθεί ότι οι πρώτες σημαντικές ανακαλύψεις γύρω από το σύστημα CRISPR-Cas έγιναν από επιστήμονες που δεν είχαν στο μυαλό τους την τροποποίηση του γονιδιώματος και που δεν είχαν σχέση με την μελέτη ανθρώπινων γενετικών νόσων. Η κινητήριος δύναμη για αυτούς υπήρξε η περιέργεια για την κατανόηση του κόσμου και συγκεκριμένα του μικρόκοσμου των μικροοργανισμών ή βιομηχανικές εφαρμογές όπως για παράδειγμα η αντιμετώπιση των ιών που προσβάλλουν τα βακτήρια που χρησιμοποιούνται στην παρασκευή του γιαουρτιού.
Το επόμενο βήμα ήταν η ιδέα ότι το σύστημα CRISPR-Cas μπορεί να μετατραπεί σε πανίσχυρο εργαλείο τροποποίησης του γονιδιώματος. Ο Λιθουανός βιοχημικός Virginijus Siksnys διαπίστωσε πειραματικά ότι το σύστημα αυτό μπορεί να λειτουργήσει αυτόνομα στοχεύοντας οποιαδήποτε αλληλουχία. Σε ανάλογα συμπεράσματα κατέληξαν ένα χρόνο μετά, το 2012, η Jennifer Doudna και η Emmanuelle Charpentier. Η ομάδα του Feng Zhang απέδειξε λίγο αργότερα ότι η τροποποίηση των κυττάρων των θηλαστικών με το σύστημα CRISPR-Cas μπορεί να πραγματοποιηθεί σχετικά εύκολα, αναδεικνύοντας τις δυνατότητες για απεριόριστες εφαρμογές, ανάλογες της ανθρώπινης φαντασίας. Με τον τρόπο αυτό εγκαινιάστηκε μια νέα εποχή για την γενετική μηχανική.
Από τότε που έγινε γνωστή η ακριβής δομή και η λειτουργία του συμπλέγματος CRISPR-Cas, αυτό τροποποιήθηκε έτσι ώστε να μπορεί να ψαλιδίζει τα γονιδιώματα σε συγκεκριμένα επιθυμητά σημεία με πολύ μεγάλη ακρίβεια και μικρό κόστος. Η δημιουργία μεταλλάξεων σε μη επιθυμητές θέσεις (αστοχίες), ένα σημαντικό πρόβλημα των τεχνολογιών γονιδιωματικής τροποποίησης, είναι περιορισμένη ενώ παράλληλα η εργαστηριακή διαδικασία είναι πολύ πιο εύκολη σε σχέση με προηγούμενες τεχνικές. Πλέον θεωρείται ένα πανίσχυρο και ταυτόχρονα απλό σύστημα τροποποίησης του γονιδιώματος με ήδη πολυάριθμες χρήσεις σε πολλούς διαφορετικούς τομείς όπως στην ιατρική, στη γεωργία, στην έρευνα κλπ.
Από την γεωργία και την βιομηχανία στην θεραπεία γενετικών ασθενειών
Είτε πρόκειται για διάγνωση και θεραπεία, είτε πρόκειται για κάτι άλλο, καθημερινά έρχονται στο φως νέες ανακαλύψεις σχετικές με την τεχνολογία CRISPR-Cas. Η τεχνολογία είναι εξαιρετικά απλή, οικονομική και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την τροποποίηση του γονιδιώματος οποιουδήποτε οργανισμού, με μεγάλη ακρίβεια και αποτελεσματικότητα. Η δημιουργία μοντέλων ζώων με συγκεκριμένα χαρακτηριστικά που προσομοιάζουν τις ανθρώπινες γενετικές ασθένειες, η παραγωγή γενετικά τροποποιημένων κυττάρων προς χρήση για διάφορες θεραπείες, η δημιουργία ζώων και φυτών με επιθυμητές ιδιότητες και η παραγωγή βιοκαυσίμων είναι μόνο μερικά παραδείγματα των εφαρμογών της τεχνολογίας CRISPR-Cas.
Στην γεωργία διάφορα είδη φυτών έχουν υποστεί γενωμική επεξεργασία με την τεχνολογία CRISPR-Cas προκειμένου να είναι ανθεκτικά σε παθογόνους οργανισμούς ή σε δύσκολες καιρικές συνθήκες ή για να αυξηθεί η παραγωγή. Οι ένθερμοι υποστηρικτές των εφαρμογών αυτών διακηρύττουν ότι με την συγκεκριμένη μεθοδολογία μπορεί να καταπολεμηθεί η έλλειψη τροφής οι εξαφανίσεις ειδών που πολλαπλασιάστηκαν λόγω κλιματικής κρίσης.
Στον τομέα της υγείας, η τεχνολογία CRISPR-Cas φαίνεται πολλά υποσχόμενη. Ήδη αναπτύσσονται διαγνωστικά τεστ από διάφορες εταιρίες με σκοπό την εύκολη και γρήγορη διάγνωση μολυσματικών νόσων, βακτηριακών μολύνσεων κ.α. Μετά από μελέτες σε μοντέλα ζώων με ενθαρρυντικά αποτελέσματα προς την κατεύθυνση της θεραπείας γενετικών νοσημάτων, όπως η δρεπανοκυτταρική αναιμία, ορισμένες οαμφιβληστροειδοπάθειες και τύποι καρκίνου, ξεκίνησαν οι κλινικές δοκιμές για την εφαρμογή σε ανθρώπους. Ήδη βρίσκονται σε εξέλιξη σε Ευρώπη και Αμερική κλινικές δοκιμές για την δρεπανοκυτταρική αναιμία και την β- θαλασσαιμία.
Ελπιδοφόρα είναι και τα μηνύματα για την θεραπεία ορισμένων τύπων καρκίνου. Η τεχνολογία CRISPR-Cas σε συνδυασμό με θεραπεία με κύτταρα του ανοσοποιητικού εφαρμόστηκε σε τρεις ασθενείς με καρκίνο στο αίμα και σάρκωμα. Τα αποτελέσματα για τους εθελοντές ασθενείς ήταν περιορισμένα καθώς βρίσκονταν σε πολύ προχωρημένο στάδιο της νόσου.4 Ο σκοπός όμως της μελέτης, ο οποίος επετεύχθη, ήταν να αναδειχθεί ότι η τεχνολογία αυτή μπορεί να εφαρμοστεί με ασφάλεια στην ανοσοθεραπεία για την αντιμετώπιση του καρκίνου.
Ο ασκός του Αιόλου έχει ανοίξει
Γρήγορα έγινε αντιληπτό ότι η τεχνολογία CRISPR-Cas που μπορεί να εφαρμοστεί σε οποιοδήποτε οργανισμό τροποποιώντας το γονιδίωμά του, άρα και στον άνθρωπο, θα ξεσήκωνε πληθώρα αντιδράσεων αναδεικνύοντας σοβαρά ζητήματα βιοηθικής. Μόλις τρία χρόνια μετά την ανακάλυψή της, τον Μάρτιο του 2015, οι Κινέζοι επιστήμονες την χρησιμοποίησαν για να τροποποιήσουν γενετικά ανθρώπινα έμβρυα ενώ το 2018 ο Κινέζος ερευνητής Χε Τζιανκούι με την ομάδα του αφού τροποποίησαν ανθρώπινα έμβρυα έτσι ώστε να είναι ανθεκτικά στον ιό HIV, τα εμφύτευσαν στην μήτρα γυναικών-φορέων του ιού. Το αποτέλεσμα ήταν να γεννηθούν τρία μωρά που έχουν υποστεί γενετική τροποποίηση, με αλλαγές που είναι κληρονομικές χωρίς φυσικά την συναίνεσή τους. Τα γεγονότα αυτά προκάλεσαν παγκόσμια κατακραυγή και οι ιθύνοντες βρέθηκαν αντιμέτωποι με την δικαιοσύνη και καταδικάστηκαν σε φυλάκιση και χρηματικά πρόστιμα ένα χρόνο μετά.
Μεγάλο μέρος της επιστημονικής κοινότητας έσπευσε να καταδικάσει τις ενέργειες του Χε Τζιανκούι. Ηχηρά ονόματα στον χώρο της γενετικής μηχανικής παγκοσμίως, μεταξύ των οποίων και η Emmanuelle Charpentier, με ανοιχτή επιστολή στο περιοδικό Nature ζήτησαν την επιβολή μορατόριουμ σε όλες τις κλινικές εφαρμογές της γενετικής τροποποίησης ανθρώπινων κυττάρων που θα μπορούσαν να αλλάξουν το DNA στα γαμετικά κύτταρα ή στα έμβρυα και να οδηγήσουν στην γέννηση γενετικά τροποποιημένων παιδιών.5
Τον Δεκέμβριο του 2018 ο Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας ενέκρινε την δημιουργία διεπιστημονικό πάνελ εμπειρογνώμων με σκοπό την αντιμετώπιση των επιστημονικών, ηθικών, κοινωνικών και νομικών ζητημάτων που προκύπτουν από τις εφαρμογές της γονιδιωματικής επεξεργασίας σε ανθρώπινα κύτταρα ενώ λίγους μήνες μετά ανακοίνωσε την δημιουργία μητρώου προκειμένου να παρακολουθούνται τα εργαστήρια που ασχολούνται με την επεξεργασία του ανθρώπινου γονιδιώματος. Παράλληλα 13 εταιρείες κολοσσοί της βιοτεχνολογίας σε κοινή διακήρυξη δεσμεύτηκαν να απαγορεύσουν την τροποποίηση του DNA σε κύτταρα βλαστικής σειράς και να συμμετέχουν σε κλινικά επικυρωμένη θεραπευτική έρευνα σε σωματικά κύτταρα, βάσει πάντοτε των εθνικών ή περιφερειακών κανονισμών.6
Η τεχνολογία CRISPR/Cas άλλαξε ριζικά την επιστήμη ανοίγοντας νέους ορίζοντες και ελπίδες για πολλαπλά οφέλη στην ανθρωπότητα από τις θεωρητικά απεριόριστες εφαρμογές της. Παράλληλα όμως η ορθολογική αξιοποίηση της υπό τον αυστηρό έλεγχο της κοινωνίας και με σεβασμό στον άνθρωπο και στα υπόλοιπα έμβια όντα καθιστά τον εκτενή διάλογο για την χρήση της επιβεβλημένο και πιο επίκαιρο από ποτέ.
Μαρία Τσίπη
Τεχνολογία CRISPR-Cas: το χρονικό των σημαντικότερων ανακαλύψεων
* 1993 - 2005, Francisco Mojica, Πανεπιστήμιο του Αλικάντε, Ισπανία: χαρακτηρισμός των αλληλουχιών CRISPR, υπόθεση ότι πρόκειται για αμυντικό μηχανισμό των βακτηρίων.
* Μάιος 2005, Alexander Bolotin, Εθνικό Ινστιτούτο Αγροτικής Έρευνας της Γαλλίας: ανακάλυψη σημαντικών συστατικών στο σύστημα CRISPR/Cas του βακτηρίου Streptococcus thermophilus.
* Μάρτιος 2007, Philippe Horvath, Γαλλική εταιρία Danisco: πειραματική επιβεβαίωση του αμυντικού ρόλου του CRISPR-Cas στα βακτήρια.
* Δεκέμβριος 2008, Luciano Marraffini και Erik Sontheimer, Πανεπιστήμιο Νορθουέστερν, ΗΠΑ: διαπιστώνεται ότι το CRISPR στοχεύει μόρια DNA και όχι RNA.
* Μάρτιος 2011, Emmanuelle Charpentier, Πανεπιστήμιο της Βιέννης, Αυστρία: ανακάλυψη κι άλλων σημαντικών συστατικών του CRISPR-Cas.
* Ιούλιος 2011, Virginijus Siksnys, Πανεπιστήμιο του Βίλνιους, Λιθουανία: πειραματική επιβεβαίωση ότι τα συστήματα CRISPR-Cas μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε διάφορα είδη.
* Σεπτέμβριος 2012, Virginijus Siksnys, Πανεπιστήμιο του Βίλνιους, Λιθουανία: προσδιορισμός της λειτουργίας της νουκλεάσης Cas9, τροποποίησή της ώστε να στοχεύει την επιθυμητή περιοχή του DNA.
* Ιούνιος 2012, Emmanuelle Charpentier και Jennifer Doudna, Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνια, ΗΠΑ: παρόμοια συμπεράσματα με τον Virginijus Siksnys, ακόμα μεγαλύτερη απλοποίηση της διαδικασίας γενωμικης επεξεργασίας. Το άρθρο τους κατατέθηκε προς αξιολόγηση μετά το αντίστοιχο του Virginijus Siksnys αλλά δημοσιεύτηκε νωρίτερα.
* Ιανουάριος 2013, Feng Zhang, Τεχνολογικό Ινστιτούτο Μασαχουσέτης, Πανεπιστήμιο Χάρβαρντ, ΗΠΑ: πρώτη επιτυχημένη απόπειρα γονιδιωματικής τροποποίησης με CRISPR- Cas κυττάρων ανθρώπου και ποντικού.
* Αρχές του 2013 μέχρι σήμερα: δημοσίευση χιλιάδων μελετών ερευνητικών ομάδων από όλο τον κόσμο στις οποίες εφαρμόζεται η τεχνολογία CRISPR-Cas σε διάφορους οργανισμούς∙ στους μύκητες, στις μύγες, στα σκουλήκια, στα ψαράκια Zebrafish, σε ποντίκια και μαϊμούδες και τέλος στον άνθρωπο.
1 Gersbach, C.A., Genome engineering: the next genomic revolution. Nat Methods, 2014. 11(10): p. 1009-11.
2 Doudna, J.A. and E. Charpentier, Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science, 2014. 346(6213): p. 1258096.
3 Lander, E.S., The Heroes of CRISPR. Cell, 2016. 164(1-2): p. 18-28.
4 Stadtmauer, E.A., et al., CRISPR-engineered T cells in patients with refractory cancer. Science, 2020. 367(6481).
5 Lander, E.S., et al., Adopt a moratorium on heritable genome editing. Nature, 2019. 567(7747): p. 165-168.
6 Ελληνική Επιτροπή Βιοηθικής (http://www.bioethics.gr/)
Στηρίξτε την έγκυρη και μαχητική ενημέρωση. Στηρίξτε την Αυγή. Μπείτε στο syndromes.avgi.gr και αποκτήστε ηλεκτρονική συνδρομή στο 50% της τιμής.
